Бактериологическое исследование ликвора

БакпосевБактериологическое исследование ликвора состоит из бактериоскопии мазка, выделения возбудителя и его идентификации, серологическом выявлении антигенов в спинномозговой жидкости. Ликвор исследуют немедленно после доставки в лабораторию. Если жидкость мутная, посев осуществляется без предварительной подготовки.

Прозрачную жидкость центрифугируют 5 минут при 3000 об/мин, осадок высевают и микроскопируют. Из материала готовят мазок, высушивают на воздухе, фиксируют смесью Никифорова в течение 5 минут и красят метиленовым синим или по Граму в модификации Калины. Нельзя фиксировать мазки в пламени горелки или спиртовки!

Бактериоскопическое исследование проводят внимательно, тщательно просматривая как минимум 20 полей зрения, или до тех пор, пока бактерии не будут обнаружены. Прямая микроскопия позволяет установить наличие бактерий, вызвавших заболевание.

Менингококк Neisseria meningitidis могут располагаться вне клеток или внутри лейкоцитов, по Граму окрашиваются отрицательно, выглядят как диплококки, похожи на зерна кофе.

Гемофильная палочка Haemophilus influenzae в мазках — мелкие грамотрицательные коккобактерии или палочки, подвержены полиморфизму, окружены едва заметной нежной капсулой, расположены в виде коротких цепочек или нитей.

Пневмококки имеют вид ланцетовидных диплококов и коротких цепочек, образуют капсулу; они грамположительны, хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красителями, при этом капсула остается бесцветной и заметна только на окрашенном фоне.

Выделение возбудителя. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут 0,3-0,5 мл материала и по 2-3 капли засевают на сывороточный, 5% кровяной, «шоколадный» (или среду Левинталя) агар и на среду для контроля стерильности. При необходимости, в зависимости от результатов микроскопии осадка, можно дополнительно сделать посев на среды ЖСА (желточно-солевой агар) и Эндо.

Такое разнообразие сред, которое  используется для первичного бактериологическое исследование спинномозговой жидкости, позволяет ускорить выделение микроорганизмов, которые могут быть факторами бактериальных менингитов. Посевы помещают в термостат при температуре (37 ± 1)°С и создают условия с повышенной концентрацией СО2 (5-10%).

При наличии достаточного количества ликвора рекомендуется 2-3 капли засеять на чашку со средой АГВ или средой Мюллера-Хинтона и определить чувствительность микроорганизма к антибиотикам.

Остальную спинномозговую жидкость используют для проведения серологических исследований (реакции коаглютинации, латекс-агглютинации, иммуноферментного анализа), полимеразной цепной реакции и т.д. и для посева на среду обогащения (4 см3  0,1% полужидкого агара с 1 см3 сыворотки). Посевы ликвора выдерживают в термостате до 7 суток при температуре (37 ± 1)°С с периодическими высевами на твердые питательные среды.

Через 24 часа визуально и с помощью стереоскопического микроскопа просматривают все чашки с посевами независимо от результатов предыдущей бактериоскопии ликвора. Чашки без роста инкубируют еще сутки. Во внимание принимают все разновидности колоний.

Менингококк на сывороточном агаре образует плоские, круглые с ровным краем, нежные колонии с опалесценцией размером 2-3 мм. На «шоколадном» и кровяном агаре его колонии нежные, сероватого цвета, с блестящей поверхностью и ровными краями, имеют маслянистую консистенции, размерами до 3,0 мм. Менингококки не изменяют цвета среды.

Гемофилы на «шоколадном» агаре дают достаточно пышное разрастание, им присущ резкий специфический запах индола. Колонии серого цвета, плоские, диаметром 0,2-2,0 мм, легко снимаются со среды. На кровяном агаре через сутки появляются мелкие прозрачные колонии, похожие на капельки росы или вообще рост может отсутствовать. На МПА (мясопептонном агаре) и сывороточном агаре Haemophilus influenzae не растет.

Колонии пневмококков на кровяном, как и на «шоколадном» агаре, мелкие (диаметром 0,1-1,0 мм), сероватые, плоские, иногда с вдавленным центром, окруженные зоной a-гемолиза. По внешнему вида колонии пневмококков трудно отличить от колоний стрептококков группы В, других «зеленящих» стрептококов — SS.mitis, oralis, sanguis, parasanguis, gordonii и энтерококков (Е.faecalis), которые в некоторых случаях могут вызвать менингит, особенно у детей до 1 года.

На сывороточном агаре пневмококки образуют мелкие, нежные едва желтоватые колонии. Пневмококки при росте на кровяном агаре могут давать несколько типов колоний, что зависит от того, насколько выражена капсула. Колонии пневмококка с развитой капсулой могут иметь несколько миллиметров в диаметре и быть настолько слизистыми, что напоминают каплю масла на поверхности агара. Их распознавание не вызывает затруднений. Штаммы, в которых не выражена капсула, дают колонии небольших размеров и их выделение связано с определенными трудностями.

При просмотре этих колоний в стереоскопическом микроскопе можно разглядеть характерные морфологические особенности роста этого микроорганизма: сероватый оттенок колоний, выпуклая поверхность и влажная «сметаноподобная» консистенция. При длительном инкубировании (48 часов и более) центральная часть колонии может опуститься, придавая ей характерную блюдцеобразную форму (это в определенной степени объясняется действием аутолизинов пневмококка). Некоторые штаммы могут давать абсолютно сплющенные колонии.

В последнее время наблюдаются единичные случаи и вспышки гнойных менингитов, вызванных пиогенным стрептококком (S.pyogenes). Колонии этого возбудителя легко отличить от других стрептококков по зоне a-гемолиза на кровяном агаре.

Большие (3-5 мм) колонии, которые содержат в себе грамнегативные палочки, следует заподозрить в принадлежности к энтеробактерям и псевдомонадам.

Грибы рода Candida растут на всех средах, не меняя цвет агара с кровью.

Микроорганизмы рода Acinetobacter хорошо растут на кровяном и сывороточном агаре, а также на питательных средах без добавления нативного белка. Образуют крупные, белые, круглые и блестящие, часто слизистые колонии, на средах с кровью могут давать зону гемолиза.

Для определения чистоты культуры и дальнейшего пути идентификации готовят мазки, окрашивают по Граму, ставят реакцию с 3% раствором КОН и первые простые биохимические тесты на оксидазу, каталазу (при подтверждении чистоты культуры), а также отсеивают колонии на элективные среды для накопления чистой культуры для дальнейшей идентификации.

Учитывая характер роста, морфологию клеток и результаты указанных биохимических тестов, решают вероятную принадлежность выращенного микроорганизма к тому или иному роду и выбирают путь дальнейшего его изучения и идентификации.

Колонии, подозрительные на менингококк, отсеивают на среду СА для получения и накопления чистой культуры, которую в дальнейшем идентифицируют по характерным свойствам и изучают ее чувствительность к антибиотикам. Для дифференциации N.meningitidis и B. (M) catarrhalis культуру отсеивают в две пробирки с СА и одну — с питательным агаром (МПА). Посевы на СА выращивают параллельно при температуре (37±1)°С и (22±1)°С, на МПА — при (37±1)°С.

Одновременное культивирование выделенного возбудителя на МПА и СА является простым и надежным тестом при микробиологическом исследовании спинномозговой жидкости, позволяющим дифференцировать Neisseria meningitidis, которая не способна расти на СА при (22±1)°С и на МПА при (37±1)°С, от похожей на нее B.( M) catarrhalis. Изучают биохимические свойства нейссерий: отсутствие роста на агаре с 0,2% содержанием желчи или задержка роста вокруг дисков с желчью; активность в отношении углеводов (глюкозы, мальтозы, сахарозы, фруктозы, лактозы) редукция нитратов; способность образовывать полисахарид на среде с 5% содержанием сахарозы.